مقایسه روش‌های NGS-Based و Microarray-Based برای انجام تست NIPT (Non-Invasive Prenatal Testing)

با وجود تکنولوژی‌های مختلف NIPT از جمله توالی‌یابی کل ژنوم  (WGS)که به روش های NGS-Based انجام میشود، پلی‌مورفیسم تک‌نوکلئوتیدی  (SNPs)، میکرواری، و تقویت چرخشی حلقوی (RCA=Rolling Circle Amplification)، وجود دارد، درک دقت و قابلیت اطمینان هر روش برای تصمیم‌گیری‌های بالینی ضروری است.

با این حال، ارزیابی‌های جامع برای مقایسه عملکرد این روش‌ها، به‌ویژه از نظر مقادیر پیش‌بینی‌کننده برای تشخیص تریزومی، محدود باقی مانده‌اند.

تمامی این روش ها از جنبه‌های مختلف، مانند دقت، پوشش ژنتیکی، هزینه، زمان و کاربردها، اهمیت دارد که بدقت مورد بررسی قرار گیرند.

در ادامه یک مقایسه دقیق و علمی بین این دو روش مطرح یعنی روش های NGS-Based و Microarray ارائه شده است:

1-       پایه تکنولوژی

NGS  توالی DNA را تحلیل می‌کند و اطلاعات جامع‌تری از ژنوم ارائه می‌دهد، و قادر به شناسایی طیف وسیع‌تری از تغییرات ژنتیکی، از جمله تغییرات در تعداد نسخه‌های ژن(CNV) و پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی(SNP) می‌باشد.

در حالی که روش میکروآری بر نواحی خاصی از ژنوم تمرکز دارد و تحلیلی هدفمند از همان نواحی ارائه می‌دهد و برای شناسایی آنوپلوئیدی‌های شایع مانند تریزومی ۲۱، ۱۸ و ۱۳ مناسب است.

در روش Microarray از یک میکروآرایه استفاده می‌شود که شامل مجموعه‌ای از نواحی کوچک DNA است که به سطحی جامد متصل شده‌اند.

قطعات cfDNA با استفاده از PCR تقویت شده، با پروب‌های فلورسنت نشاندار شده و به توالی‌های مکمل روی میکروآرایه متصل می‌شوند.

شدت نور فلورسنت و محل اتصال، مقدار نسبی DNA و وجود یا عدم وجود هدف را نشان می‌دهد.

انحراف از تعداد مورد انتظار سیگنال فلورسنت، نشان‌دهنده وجود آنوپلوئیدی است.

2-      دقت (Accuracy) و حساسیت

در حالی که NGS معمولاً دقیق‌تر از سایر روش‌های NIPT است، اما حساسیت و ویژگی آن ممکن است بسته به تکنولوژی توالی‌یابی و تحلیل بیوانفورماتیکی مورد استفاده، متفاوت باشد.

در مجموع، برای تشخیص تریزومی‌های شایع جنینی، روش‌های مختلف NIPT از نظر حساسیت بالینی، ویژگی و NPV عملکرد مشابهی دارند.

تمامی روش‌های NIPT برای تشخیص T21 حساسیتی بالاتر از ۹۷٪ داشته‌اند که از غربالگری‌های سنتی بیشتر است.

برای تشخیص T18، روش هدفمند همراه با میکرواری (Harmony) حساسیت پایین‌تری نسبت به سایر آزمون‌ها دارد.

تمام تست‌های NIPT در شناسایی T18 از نظر ویژگی، عملکرد بسیار خوبی داشتند و ویژگی بالای 99٪ را نشان دادند، فارغ از روش یا محصول مورد استفاده. هیچ تفاوت معنی‌داری در PPV بین یکی از تست‌های  NGS، تست SNP و تست مبتنی بر میکروآرای مشاهده نشد (به ترتیب: 98.05٪، 95.31٪ و 100٪).

هر روش NIPT دارای NPV  بالایی (همگی بالای 99٪) برای تشخیص T18 بود.

برای تشخیص T13، تمامی روش‌ها از نظر حساسیت، ویژگی، PPV و NPV عملکرد مشابهی داشتند. تمام روش‌های NIPT NPV بالای 99٪ برای T13 داشتند.

3-      پوشش ژنومی و قابلیت تشخیص

ماهیت جامع NGS ممکن است منجر به شناسایی یافته‌های تصادفی (Incidental Findings) شود که ارتباط مستقیمی با اختلال ژنتیکی مورد بررسی ندارند.

در حالیکه میکروآری برای شناسایی انواع وسیع‌تری از تغییرات ژنتیکی که خارج از نواحی هدف‌گذاری‌شده هستند، مناسب نیست.

4-       هزینه و زمان

در مقایسه با روش سانگر، NGS  مقدار بسیار بیشتری DNA را با هزینه‌ای به مراتب کمتر و با سرعت بالاتر توالی‌یابی می‌کند.

5-       انعطاف‌پذیری و آینده‌نگری

6-       فرآیند کاری پیچیده

NIPT مبتنی بر NGS شامل مراحل متعددی مانند استخراج DNA، توالی‌یابی و تحلیل بیوانفورماتیکی است که آن را نسبت به سایر روش‌ها پیچیده‌تر می‌کند.

7-       موارد کاربرد

8-      میزان عدم موفقیت و یا Failure rate

انجام تست NIPT  مبتنی بر NGS با تجزیه و تحلیل کل ژنوم، جامع‌ترین نتایج را ارائه می‌دهد.

بنابراین، انتظار داریم که این روش نرخ عدم موفقیت کمتری نسبت به توالی‌یابی هدفمند یا پلتفرم‌های مبتنی بر آرایه دارد، زیرا پوشش گسترده‌تری از ژنوم را در بر می‌گیرد.

مطالعه‌ای توسط Gil و همکاران (2017) در قالب یک فراتحلیل به این موضوع پرداخته و به اصطلاح «عدم نتیجه» در تست‌های cfDNA اشاره کرده است.

سه دلیل اصلی برای این موضوع شامل: مشکلات در جمع‌آوری خون و حمل نمونه (شامل همولیز و تجزیه و تکه تکه شدن قطعات DNA و ...) با نرخ بین 0.03 تا 11.1 درصد، درصد پایین cfDNA جنینی (کمتر از 4 درصد) با نرخ 0.1 تا 6.1 درصد، و شکست در اجرای آزمایش (استخراج، تکثیر یا توالی‌یابی DNA) می‌باشند.

آن‌ها همچنین اعلام کردند که ارتباط مشخصی بین نرخ شکست و نوع روش تحلیلی مورد استفاده یافت نشد، اما نرخ شکست در ناهنجاری‌های کروموزوم‌های جنسی بیشتر از تریزومی‌ها بود.

نگاهی به نرخ شکست در روش‌های مختلف نشان داد که: در روش NGS این نرخ بین 0.24% تا 1.46% بود؛ در روش میکروآرایه تا 3.2% (بین 0.04–3.2%)؛ و در روش RCA بین 0.07% تا 0.93% متغیر بود.

با توجه به دلایل متعددی که برای «عدم نتیجه» ذکر شد، مقایسه مستقیم نرخ شکست بین روش‌ها قابل اعتماد نیست، چرا که تفاوت‌های متدولوژیکی و تأثیر عوامل انسانی دخیل است.

اما بطور کلی روش های NGS Based  سبت به روش‌های تعیین توالی هدفمند یا پلتفرم‌های مبتنی بر آرایه (array-based platforms)، به طور مداوم نرخ شکست (failure rate) پایین‌تری دارد.

9-      نتیجه‌گیری:

اگر هدف فقط غربالگری تریزومی‌های شایع باشد و بودجه محدودی وجود دارد (البته این مسئله برای خارج از ایران وجود دارد، چرا که هزینه دستگاه NGS  خیلی بیشتر از دستگاه های Microarray  است)، microarray  می‌تواند گزینه‌ای مقرون‌به‌صرفه باشد.

اما اگر نیاز به دقت بالا، تشخیص گسترده‌تر، یا بررسی CNVهای کوچک و نادر دارید، NGS-Based NIPT  انتخاب بهتری خواهد بود.

بر اساس این نتایج، تفاوت معنی‌داری بین روش‌های مختلف NIPT شامل WGS، SNP، میکرواری و RCA برای شناسایی تریزومی‌های شایع وجود ندارد، اما تفاوت در PPV بر اهمیت استفاده از آزمایش‌های تهاجمی برای تأیید نتایج مثبت NIPT تأکید می‌کند.

ما پیشنهاد می‌کنیم که ترکیب NIPT با سونوگرافی برای غربالگری ناهنجاری‌های ساختاری می‌تواند کارایی این آزمون‌های غیرتهاجمی را در دوران بارداری بهبود بخشد.

دلیل این است که روش هایی مثل میکرواری عمدتاً آنیوپلوئیدی‌های رایج را شناسایی می‌کند، که تنها ۴۴ تا ۶۴ درصد از کل ناهنجاری‌های کروموزومی شناسایی‌شده در تشخیص‌های پیش از تولد را شامل می‌شوند، بنابراین فناوری NGS برای NIPT بسیار انعطاف‌پذیر است و با نیازهای آزمایشگاه‌های پیشرفته و بالغ سازگار است.

در تست‌های NIPT رایج امروزی، روشNGS استاندارد طلایی محسوب می‌شود به دلیل دقت و حساسیت بالا. روش میکرواری بیشتر برای بررسی‌های تکمیلی یا در تست‌های هدفمند خاص کاربرد دارد، نه به عنوان روش اصلی در NIPT.

Bottom of Form