تست جدید DHR به روش فلوسایتومتری

تست جدید DHR (جایگزینی حساس تر از NBT) به روش فلوسایتومتری جهت بررسی فاگوسیتوز در کودکان و افراد مبتلا به بیماری های گرانولو ماتوز مزمن بیماری گرانولوماتوز مزمن (CGD; Chronic granulomatous disease) یکی بیماری‌های نقص ایمنی است که به دو فرم وابسته به کروموزوم X مغلوب (در دوسوم‌ موارد) یا اتوزومال مغلوب (در یک‌سوم موارد) به ارث می‌رسد. 
علت این بیماری جهش در یکی از ژن‌های کدکننده کمپلکس‌های پروتئینی مسئول تولید اکسیژن سوپراکسید (O-) با نام کمپلکس اکسیداز فاگوسیتی (Phox) یا آنزیم NADPH اکسیداز می‌باشد.
کمپلکس آنزیمی NADPH اکسیداز بصورت داخل غشایی در فاگوسیت‌های تک‌هسته‌ای و نوتروفیل‌ها وجود دارد. از نظر ساختاری دارای یک زیرواحد داخل غشایی کاتالیتیک دارای حلقه هِم (Heme) با نام gp91phox (یا زیرواحد آلفا که در بازوی کوتاه کروموزوم X کد می‌شود) می‌باشد که به زیر واحد تراغشایی دیگری با نام p22phox (یا زیرواحد بتا که در کروموزوم ۱۶ کد می‌شود) متصل می‌گردد.
جهش زیر واحد آلفا باعث ایجاد فرم وابسته به کروموزوم X بیماری و جهش در سایر اجزاء آنزیم منجر به فرم اتوزومال مغلوب بیماری می‌گردد.
در طی پاسخ‌های دفاعی بدن در برابر میکروب‌ها، فعال‌سازی کمپلکس آنزیمی فوق با احیاء اکسیژن مولکولی تولید ترکیبات ROS مثل رادیکال های پراکسید یا سوپراکسید (O2-) می‌کند. رادیکال‌های آزاد اکسیژن در مسیری در نهایت به اسیدهای هیپوهالوس تبدیل می‌شود که برای باکتری سمی است. این فرآیند را انفجار تنفسی (Respiratory burst) می‌گویند.
بیماری CGD اغلب در دوران کودکی ایجاد شده و با عفونت‌های راجعه قارچی و باکتری‌های داخل‌سلولی کاتالاز مثبت (که پراکسید هیدروژن را تخریب می‌کنند) همراه است. بعلت نقص در کشتن میکروب‌های فاگوسیت‌شده، لنفوسیت‌های T باعث فعال‌ کردن مداوم و مزمن ماکروفاژ‌ها شده و سبب ایجاد گرانولوما می‌شود.
در این بیماری به دلیل از بین بردن ناقص میکروب ها به علت اختلال در یکی از اجزاء کمپلکس NADPH oxidase ایجاد می شود که در این حالت فاگوسیتوز به طور کامل توسط نوتروفیل ها انجام نمی شود. بیماران مبتلا به این اختلال بدلیل از بین بردن ناقص میکروب ها (ناقص ماندن فرآیند فاگوسیتوز) گرانولوماتوز همواره با عفونت تب زا و انتشار التهاب گرانولوماتوز در بافتهایشان مواجه هستند که این امر زندگیشان را تهدید می کند. 
تشخیص به موقع و تفریق آن از سایر بیماری هایی که علائم مشابه دارند، برای این بیماران حائز اهمیت بسیار می باشد. 
اندازه گیری غیر مستقیم کاهش گونه های فعال اکسیژن (ROS) مخصوصاً هیدروژن پراکسید تولید شده توسط سیستم NADPH oxidase اساس تست DHRمی باشد. 
در این تست 1,2,3 Dihydrorhodamine در اختیار نوتروفیل های تحریک شده با PMA قرار می گیرد. 
نوتروفیل های سالم پس از بلع این ماده، آن را اکسید نموده که در نتیجه تبدیل به ماده فلوئوروسنت می شود که به وسیله دستگاه فلوسیتومتری قابل شناسایی است.
تست DHR در مقایسه با روش های همانند NBT دارای حساسیت فوق العاده زیادی است و روش بسیار دقیقی برای تشخیص بیماران و خصوصاً ناقلین CGD می باشد. 
در این تست به جای درصد سلولهای سالم اندکس اکسیداتیو نوتروفیل ها (NOI) اندازه گیری می شود. 
در تست DHR ، شدت فلورسانس در حداقل ده هزار نوتروفیل با دستگاه فلوسیتومتر بررسی شده و با نوتروفیل های تحریک نشده مقایسه می گردند 
در حالی که در تست NBT، فاگوسیتوز معمولاً در یکصد سلول و آن هم با میکروسکوپ معمولی و با چشم بررسی می گردد.
تست نیترو بلوتترازولیوم (NBT):
یکی از تست‌های تشخیصی برای CGD، تست نیتروبلو تترازولیوم (NBT; Nitroblue Tetrazolium Test) می‌باشد که تکنیکی نیمه کمی است و در سال ۱۹۶۸ توسط Park و همکارانش به عنوان تست تشخیصی اصلی برای بیماری گرانولوماتوز مزمن (CGD) معرفی شد و در سال ۱۹۷۱ توسط Feigin و همکارانش تائید و گسترش یافت.
علاوه بر این، تست NBT جهت تشخیص موارد دیگری نیز کاربرد دارد از جمله:
۱ تشخیص لکوسیتوزیس باکتریایی از عفونت‌های با منشا غیر باکتریایی.
۲ تشخیص پاسخ به درمان‌های آنتی‌بیوتیکی.
۳ مانیتور افراد مستعد به ابتلای عفونت‌های باکتریایی.
۴ اخیراً تست NBT برای پیگیری بیماری لیشمانیوزیس روستایی پیشنهاد شده است.
نیترو بلوتترازولیوم ماده‌ای زردکم‌رنگ و شفاف در معرض فاگوسیت‌ها قرار می‌گیرد و توسط آنها بلعیده می‌شود. 
این ماده توسط آنزیم اکسیداز فاگوسیتی احیاء و ایجاد رسوب ارغوانی در فاگوسیت‌ها می‌شود. 
در افراد مبتلا به CGD، احیاء NBT صورت نگرفته (تست منفی) و رسوب ارغوانی ایجاد نمی‌شود.
در این تست، محلول نیتروبلو تترازولیوم زردرنگ، زمانی که به‌وسیله‌ی NADPH اکسیداز موجود در نوتروفیل های فعال‌شده احیاء می‌شود، به رسوب آبی- خاکستری‌رنگ فورمازان تبدیل می‌شود. 
میزان احیای NBT با محاسبه‌ی درصد نوتروفیل‌هایی که در سیتوپلاسمشان رسوب فورمازان ایجادشده از طریق بررسی میکروسکوپی به دست می‌آید. 
میزان NBT احیاءشده متناسب با میزان رادیکال‌های اکسیژن تولیدی به‌وسیله‌ی فاگوسیت‌ها در انفجار تنفسی دارد.
در صورتی که نوتروفیل‌های بیمار توانایی تولید سوپرتکسید را نداشته باشند، رسوب فوق مشاهده نمی‌گردد.
برای انجام تست، نمونه‌ی خون هپارینه با محلول NBT انکوبه شده، از آن اسمیر تهیه می‌شود و پس از رنگ‌آمیزی تحت بررسی میکروسکوپی قرار می‌گیرد تا درصد نوتروفیل‌هایی که رسوب فورمازان در آنها تشکیل‌شده مشخص شود. این درصد معمولاً  در عفونت‌های باکتریال افزایش پیدا می‌کند. قابل توجه است که خون حاوی هپارین یا EDTA جهت تست NBT تا حدود یک ساعت در ۲۵ درجه سانتیگراد پایدار است.
در بعضی بیماری‌ها که با نقص متابولیک عملکرد نوتروفیل‌ها همراه‌اند، حتی زمانی که عفونت باکتریایی فعال وجود داشته باشد، تست NBT کم یا نرمال نشان داده می‌شود. 
این شرایط با تغییر دادن تست NBT در جهت نشان دادن‌ تحریکات in vitro سیستم فاگوسیت، ممکن است قابل‌تشخیص باشد. 
این تحریک می‌تواند به‌وسیله‌ی ذرات لاتکس، زایموزان، اندوتوکسین باکتری یا غلظت بالای هپارین در ترکیب خون-NBT انکوبه ایجاد گردد.
تحریک In vitro خونی که از فرد نرمال –بدون نقص هومورال یا سلولار و بدون نقص متابولیسم گرانولوسیت ها- گرفته‌شده، افزایش درصد فورمازان درون نوتروفیل ها را نشان خواهد داد. سلول‌های بیماران دارای نقص (مانند CGD)، حتی اگر تحریک صورت بگیرد، پاسخ مثبت نشان نمی‌دهند.
ملاحظاتی در مورد تست NBT:
تفسیر تست:
دامنه طبیعی ۹۵%-۹۰%
نقص در انفجار تنفسی ۱۵%-۰%
حامل ۵۵%-۳۵%
تعدادی از عوامل تکنیکی که در تست NBT اثر می‌گذارند:
۱ مدت‌ زمان و دمایی که خون پیش از آزمایش نگه‌داری می‌شود.
۲ مدت‌زمان و دمایی که ترکیب خون-NBT انکوبه می‌شود.
۳ غلظت هپارین یا NBT.
۴ استفاده از خون مویرگی به‌جای خون وریدی.
۵ معیارهای انتخابی برای تشخیص سلول‌های مثبت و منفی.
۶ استفاده از ضد انعقاد EDTA (زیرا باعث مهار پاسخ NBT می‌شود).
توجه! تأثیر مهاری EDTA با انجام تست روی باقی کوت، از بین می‌رود.
مقادیر نرمال یا کم تست، در غیاب عفونت باکتریال در موارد زیر گزارش می‌شود:
۱ بیماری‌های ویروسی
۲ روماتوئید آرتریت
۳ سرطان
۴ زنان بعد از زایمان
۵ بیماران بعد از عمل جراحی
مقادیر نرمال یا کم تست، در حضور عفونت باکتریال در موارد زیر گزارش می‌شود:
۱ عفونت‌های موضعی
۲ بیماری گرانولوماتوز مزمن
۳ نبود میلوپراکسیداز و گلوکز-۶-فسفات دهیدروژناز در نوتروفیل
۴ آگاماگلوبولینمی مادرزادی یا اکتسابی
۵ بیماری لوپوس
۶ لوکمی میلوییدی مزمن
۷ دیابت
مقادیر افزایش‌یافته در موارد زیر گزارش می‌شود:
۱ عفونت‌های باکتریال
۲ عفونت‌های نوکاردیایی و دیگر عفونت‌های قارچی
۳ عفونت‌های انگلی مانند مالاریا
مقادیر افزایش‌یافته تست، در غیاب عفونت باکتریال در موارد زیر گزارش می‌شود:
۱ نوزادان تا دو ماهگی
۲ بارداری
۳ سندرم چدیاک هیگاشی
۴ هموفیلی
۵ بیماری هوچکین و دیگر لنفوم ها
۶ سندرم بهجت
۷ بیماری التهابی روده
۸ هپاتیت ویروسی
۹ مننژیت ویروسی

پرسش و پاسخ